PRÁCTICA 14: DETERMINACIÓN DEL FACTOR Rh POR PCR.

1.OBJETIVO.

El objetivo de esta práctica es aprender los principios básicos de la PCR mediante el estudio de la determinación del Rh.

2.FUNDAMENTO.

La PCR ha revolucionado la investigación y diagnostico basado en la biología molecular. La PCR es una técnica de amplificación del ADN que permite obtener millones de copias idénticas de un fragmento concreto de ADN partiendo de una mínima cantidad de ADN molde.

Fue ideado por Kary Mullis en 1985 , utilizando polimerasa de ADN termoestables extraidos de microorganismos termófilos, como la Taq Polimerasa, extraida de Thermus Aquaticus.

  3.MATERIALES.

Microtubos Eppendorf

Pipeta regulable

Puntas de micropipeta

Gradilla

Mix PCR

Espectrofotómetro

 Termociclador

Cubeta de espectrofotómetro

4. PROCEDIMIENTO.

En la práctica pasada, tras la centrifugación obtuvimos el ADN genómico en un tubo Eppendorf y lo metimos en el congelador.

Esta práctica comienza sacando los tubos del congelador y atemperándolos. Una vez atemperados comenzamos:

1.Cogemos 2,5 µl de la muestra de ADN y la depositamos en un microtubo. Con otra punta de pipeta cogemos 22,5µl de MIX PCR, mientras la pipeteamos la resuspendemos y la vertemos en el microtubo que contiene la muestra. Este tubo contiene 25 µl en total.

2.Una vez realizado esta parte del procedimiento lo metimos en el termociclador durante 4 horas, después del termociclador lo metimos en el congelador.

3.Aprovechando lo que quedaba de muestra utilizamos el espectrofotómetro para hallar la absorbancia y después averiguar si presenta alguna contaminación.

5.RESULTADOS Y ANÁLISIS DE RESULTADOS.

Con la absorbancia vamos a averiguar si presenta alguna contaminación.

Para averiguar si tiene contaminación por proteinas dividimos la absorbancia a 260 entre la 280. Para ADN se acepta entre 1,7-2.

A260/A280= 1,54.

Esta contaminado por exceso de proteinas, su solución sería añadir Proteinasa K.

Cuando se mide en cubetas de 10 mm de paso óptico, las equivalencias (factores de conversión) son:

1 unidad de absorbancia = 50 μg/ml de ADNds, 37 μg/ml de

ADNss, 40 μg/ml de ARN o 33 μg/ml de oligonucleótidos.

Para realizar cálculos, se debe multiplicar por el factor de dilución y restar la absorbancia a 320 nm.

μg/ml = (A260-A320) · Factor de dilución · Factor de conversión

6.CONSIDERACIONES DE SEGURIDAD.

-Mantener el orden en el área de trabajo para evitar cualquier accidente.

-Examinar los instrumentos antes de utilizarlos, para evitar accidente por rotura.

-Uso correspondiente de EPI.

-Uso de cabina de bioseguridad.

7.GESTIÓN DE RESIDUOS.

Todos los residuos generados fueron desechados en un recipiente etiquetado como residuos.