PRÁCTICA 13: EXTRACCIÓN DE ADN A PARTIR DE SANGRE TOTAL , BUFFY COAT Y FLUIDOS BIOLÓGICOS.
1.OBJETIVO.
El objetivo de esta práctica es una rápida extracción y purificación de ADN genómico de alta calidad a partir de sangre total, suero, plasma y fluidos biológicos utilizando Spin columnas con membrana de sílica que une selectivamente el ADN.
2.FUNDAMENTO.
Los estudios en Biología Molecular y Citogenética requieren trabajar con muestras de ADN o ARN puras. Por eso, es necesario conocer las técnicas que nos permiten seleccionar, obtener y preservar las muestras para poder obtener resultados fidedignos.
La purificación consiste en separar los ácidos nucleicos de los demás componentes del lisado (debris)
Para la purificación tendremos en cuenta diversas propiedades de los ácidos nucleicos:
• En medio alcalino, el ADN se desnaturaliza (proceso reversible), pero el ARN se hidroliza.
• La concentración de sales permite la solubilidad diferencial de ADN, ARN y proteínas (sobre todo si son desnaturalizadas).
• Los ácidos nucleicos son insolubles en alcoholes.
3.MATERIALES Y REACTIVOS.
Los materiales utilizados fueron:
Proteinasa K
2 microtubos de 1.5ml
Muestra de sangre
Tampón de lisis/Unión
Vortex
Incubadora
Etanol 96-100%
Reservorio y tubo de recogida de la spin columna
Tampón de desinhibición
Tampón de lavado
Centrifuga
4.PROCEDIMIENTO.
Antes de realizar la purificación de ADN necesitamos una muestra de sangre, así
que procedimos a la extracción de la sangre.
Una vez obtenida la sangre la metimos en el frigorífico porque ese dia no nos daba tiempo a realizar la práctica entera.
El día 18/03 continuamos con la práctica: sacamos las muestras de sangre del frigorífico y las atemperamos un poco con la mano, una vez realizado, comenzamos con la práctica.
Como sabemos la técnica aséptica es muy importante en el laboratorio por lo que para introducir todos los materiales en la cabina de bioseguridad tenemos que esterilizarlos con etanol, presentando la persona que lo vaya a realizar el EPI correspondiente.
Una vez introducidos los materiales esterilizados en la cabina comenzamos con la práctica:
1.Pipeteamos 25 µl de proteinasa K en un microtubo de 1.5 ml.
Utilizamos puntas de micropipeta
con filtro.
2. Una vez obtenida la proteinasa K en el microtubo de 1,5 ml le añadimos 300 µl de muestra.
3. Añadida la muestra al microtubo,añadimos 300 µl del Tampón de Lisis/ Unión. Una vez añadido, utilizamos el Vortex.(10–20 s). Incubamos el resultado a 70ºC durante 15 minutos.
Sangre obtenida después de añadir la
proteinasa K y el tampón de lisis.
4. Una vez incubado el resultado añadimos 300 µL etanol (96–100 %) a cada muestra y vortex.
5. Después del vortex pipeteamos la mitad del lisado en en el reservorio de la Spin columna con su tubo de recogida.
La spin columna una vez puesto el reservorio
y el tubo de recogida.
Pipeteando el lisado, para que la centrifuga estuviese compensada
todos pipeteamos 450µL.
Centrifugamos a 10.000 rpm durante 60 segundos
y eliminamos el tubo de recogida.
6. Repetimos el punto 5 con la otra mitad del lisado.Por mal interpretación,
añadimos de nuevo 300 µL de alcohol a esta otra mitad y para diferenciarla
le pusimos 4 y un corazón.
El 4❤ es el señalado. Este es el resultado antes de
desechar el tubo de recogida.
7. Colocamos la Spin columna en un nuevo tubo de recogida
y añadimos al reservorio 500 µl de Tampón de Desinhibición.
Centrifugar a 12.000 rpm durante 60
segundos. Eliminar el líquido.
8. Añadimos 500 µl de Tampón de Lavado en el reservorio de la Spin columna. Centrifugamos a 12.000 rpm durante 60 segundos y eliminamos el líquido.
9. 2º Lavado. Añadimos 500 µl de Tampón de Lavado en el reservorio de la Spin columna.
Centrifugamos a 14.000 rpm durante 60 segundos y eliminamos el líquido
.
10. Centrifugamos a máxima velocidad durante 2 minutos para eliminar el etanol residual.
11. Eliminamos el tubo de recogida y insertar la spin columna en un microtubo de 1.5 ml . Añadimos 200 µl de Tampón de elución (precalentado a 70ºC)en el reservorio de la spin microcolumna e incubamos 1 minuto.
12. Centrifugamos a máxima velocidad durante 60 segundos. El microtubo contiene ahora el ADN genómico.
5.RESULTADOS Y ANÁLISIS DE RESULTADOS.
Hasta que no realicemos la pcr no sabremos los resultados, pero durante la práctica hemos ido observando ciertos cambios, como por ejemplo, al incubar el lisado se volvió marrón.
6.CONSIDERACIONES DE SEGURIDAD.
-Mantener el orden en el área de trabajo para evitar cualquier accidente.
-Examinar los instrumentos antes de utilizarlos, para evitar accidente por rotura.
-Uso correspondiente de EPI.
-Al tratar con agujas tener cuidado cuando has terminado de utilizarla.
7.GESTIÓN DE RESIDUOS.
Todos los residuos generados con sangre fueron desechados
al contenedor de residuos biológicos.
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