PRÁCTICA 9: Cariotipo en sangre periférica.(PARTE 3)

SACRIFICIO DE SANGRE.

1.OBJETIVO:

El principal objetivo de esta práctica es la realización de la extensión de sangre sobre portaobjetos limpios para en la siguiente práctica poder realizar el bandeo y la tinción de los cromosomas.

2.FUNDAMENTO:

La Citogenética es el estudio de los cromosomas y de las enfermedades relacionadas con ellos, por un número o estructura anómalos. 

El cromosoma de una células eucariota es una estructura organizada formada por una molécula lineal de ADN y un conjunto de proteínas (histónicas y no histónicas). Normalmente no se pueden observar con un microscopio óptico, pero durante la metafase de la mitosis se condensan lo suficiente como para poder observarse con 

1000 aumentos= cromosoma metafásico.

En esta práctica utilizaremos la colchicina, que es un fármaco antimitótico que detiene o inhibe la división celular en metafase o anafase, por lo que podremos observarlos en la siguiente práctica.

3.MATERIALES Y REACTIVOS.

Colchicina(0.25ml)

Centrifugadora

Cultivo de sangre periférica

Pipeta Pasteur A(pipeta de trabajo)

Pipeta Pasteur B(Pipeta para rellenar)

Pipeta Pasteur C(Pipeta limpia)

Micropipeta

Puntas de micropipeta

4.PROCEDIMIENTO.

En la práctica anterior, dejamos el cultivo de sangre en la estufa a 37 grados durante 72 horas, así que ahora tras las 72 horas recogemos los tubos.

Una vez recogidos comenzamos con la práctica:

1. Ajustamos la micropipeta y añadimos con la micropipeta en el tubo de la siembra 0,25ml de Colchicina(1). Lo agitamos suavemente y lo dejamos durante 45 minutos en el baño termostático a 37 grados.

2.Después de sacarlo del baño lo centrifugamos 5 minutos a 1000 rpm. Cuando finalice la centrifugadora eliminamos el sobrenadante con la pipeta pasteur de trabajo(a) y echamos el desecho en el vaso de precipitados etiquetado como residuos.

Esto es lo que conseguimos eliminando

el sobrenadante.

3. Es el turno del CHOQUE HIPOTÓNICO. 

Añadimos con la pipeta pasteur B 5ml de KCl del bote común, provocando que se produzca una lisis celular y salga el material de la membrana de la célula. Para ello seguimos los siguientes pasos:

a) Primero añadimos 1ml y lo mezclamos despacio con la pipeta de trabajo.

b)Luego añadimos los otros 4 ml despacio con otra pipeta pasteur(B) a la vez que se va pipeteando con la pipeta A, para que se mezclen con cuidado.

4.Una vez realizado el paso anterior, volvemos a centrifugar el tubo 5 minutos a 1000 rpm. Cuando finalice, eliminamos el sobrenadante con la pipeta de trabajo A y echamos el desecho en el vaso de precipitados etiquetado como residuos dejando aproximadamente 0,5ml.

5. Añadimos con una pipeta Pasteur limpia (C) 1ml de fijador. El fijador es una solución Carnoy que consiste en 3 partes de metanol/1 parte de ácido acético. Esta solución se debe resuspender bien con la pipeta (A) muy despacio.

 Luego con la pipeta C poco a poco añadimos 4ml de fijador, resuspendemos con A.

6.Volvemos a centrifugar 5 minutos a 1000 rpm y repetimos el paso 4 y 5 las veces que sea necesarias hasta que este totalmente limpio y blanco el precipitado.

Este es el resultado obtenido tras tres 

lavados.

7. El último paso, las extensiones en el portaobjetos. Echaremos 4-5 gotas sobre los portaobjetos a una distancia de 5-10cm de altura al centro del porta y dejamos resbalar la gota para que se extienda sobre la superficie. El porta debe estar previamente mojado con agua fría

Una vez realizada las extensiones etiquetamos los portas y los llevamos a un lugar 

y esperamos 72 horas.

6.RESULTADOS Y ANÁLISIS DE RESULTADOS.

Aquí voy a anotar algunas observaciones que he apuntado durante la práctica.

-Cuando al medio le añadimos la colchicina lo removemos para que todas las células entren en contacto con la colchicina.

-La colchicina sirve para detener el crecimiento de las células en metafase o anafase.

-Cuando realizamos las centrifugaciones, tuvimos que quitar el tubo de plástico que contenía por que si no descompensaría la centrifugadora y no se centrifugaría bien.

-El medio adquiere ese color después de añadir el fijador por la metabolización de la hemoglobina.

7.CONSIDERACIONES DE SEGURIDAD.

-Mantener el orden en el área de trabajo para evitar cualquier accidente.

-Examinar los instrumentos antes de utilizarlos, para evitar accidente por rotura.

-Uso correspondiente de EPI.

8.GESTIÓN DE RESIDUOS.

Las puntas de micropipetas fueron desechadas a un vaso de precipitado que ponía residuos y fue desechada a un contenedor de residuos biológicos. El vaso de precipitados que contenía sobrenadante fue diluido en agua.