PRÁCTICA 9: Cariotipo en sangre periférica.(PARTE 2)

SIEMBRA DE SANGRE PERIFÉRICA.

1.OBJETIVO:

El objetivo de esta parte de la práctica 9 es realizar un cultivo celular de sangre periférica para que los linfocitos T proliferen.

2.FUNDAMENTO:

El cultivo celular es el conjunto de técnicas que permiten el mantenimiento de células in vitro, manteniendo al máximo sus propiedades fisiológicas, bioquímicas y genéticas.

• Ventajas:

‒ Permiten un control preciso y fino del medio ambiente

‒ Homogeneidad de la muestra

Se pueden controlar las condiciones físico-químicas (pH,temperatura, presión osmótica, presión parcial de O2 y CO2) y fisiológicas (hormonas, factores de crecimiento, densidad celular…)

Aunque la muestra de tejido original sea heterogénea, tras uno o dos pases las líneas celulares se vuelven homogéneas, lo que favorece mucho el tratamiento estadístico de los resultados.

‒ Economía

Al acceder directamente a las células, se requieren menores concentraciones de sustancias comparado con el animal o planta completo, además de que no sufren alteraciones metabólicas. Esto reduce el coste de los ensayos clínicos y permite hacer mayor número de pruebas.

‒ Cuestiones éticas

En muchas situaciones permite sustituir al ensayo in vivo, ahorrando gran número de sacrificios de animales de experimentación.

• Desventajas:

‒ Sensibilidad

Se requieren estrictas condiciones de asepsia, porque el crecimiento de las células es más lento que el de los contaminantes más habituales (hongos, levaduras, bacterias, micoplasmas…).

‒ Cantidad y coste

Producir hasta 10 gramos de cultivo no es muy costoso, pero para obtener cantidades superiores a 100 gramos (escala industrial) supone una considerable inversión (biorreactores).

‒ Inestabilidad

Muchas líneas celulares continuas son inestables, adoptando dotaciones cromosómicas aneuploides que alteran los resultados. Para ello se resiembra cada cierto tiempo a partir del stock congelado.

‒ Desdiferenciación de las células

Al propagarse, las células pierden las características fenotípicas propias del tejido del que proceden (desdiferenciación).

‒ Validez del modelo in vitro

Un cultivo celular pierde ciertas características:

•  Se pierde la organización tridimensional, ya que se propagan en dos dimensiones.
• Se pierden las interacciones entre células y con la matriz.
•  Carecen de los componentes de regulación homeostática in vivo, como el sistema nervioso y endocrino.

Por tanto, se debe ser precavido en cuanto a la validez de los resultados obtenidos.

3.MATERIALES Y REACTIVOS:

Los materiales utilizados en esta práctica fueron:

Micropipeta 100-1000μl

Gradilla

Tubo de hematología con heparina(contiene 1 ml

de sangre)

Tubo con el medio de cultivo

Fitohemaglutinina

4. PROCEDIMIENTO:

1. Los medios de cultivo están congelados por lo que debemos atemperarlos, así que lo metemos en el baño termostático.

2. Mientras los medios de cultivo se atemperan, un profesor licenciado en enfermería vino a clase a sacar la sangre para poder realizar la práctica.

3. Una vez obtenida la muestra, nos dirigimos al baño termostático para comprobar si los tubos con el medio de cultivo ya están descongelados.

4.La muestra obtenida es de 4 ml de sangre y el tubo contiene heparina(1).

5.En esta práctica tenemos que llevar a cabo también la técnica aséptica por lo que encenderemos la cabina de flujo laminar para que actúe sobre la superficie mientras preparamos los materiales necesarios.

6. Una vez que hayamos conseguido los materiales procedemos con la práctica.

7. Utilizando guantes y alcohol vamos desinfectando todos los materiales y los vamos introduciendo a la cabina, una vez desinfectados todos, nos rociamos las manos con alcohol para desinfectarlas e introducimos las manos en la cabina para trabajar. Nos colocamos en una posición cómoda para realizar el trabajo adecuadamente y colocamos los instrumentos del interior como nos sea más cómodo a la hora de utilizarlos.

8. En la gradilla se encuentra el tubo con el medio de cultivo, así que desenroscaremos el tapón y lo colocaremos fuera de nuestro alcance para no pasar las manos por encima y contaminarlo. Lo mismo con el tubo de la fitohemaglutinina(2). El de la sangre aún no es necesario por que no lo vamos a utilizar aún.

9. Una vez desenroscados ambos tapones, fijamos el volumen en la micropipeta (250 μl= 0.25 ml), cogemos la punta de pipeta y la introducimos en el tubo que contiene la fitohemaglutinina. Una vez adquirida la fitohemaglutinina la llevamos al tubo donde se encuentra el medio de cultivo y apoyando la punta en la pared, vaciamos el volumen de la micropipeta en el tubo.

10. Una vez depositado, cerramos el tapón de la fitohemaglutinina y lo ponemos al fondo de la gradilla ya que ya la hemos utilizado. A continuación desenroscamos el tapón de la sangre, y lo colocamos fuera de nuestro alcance para no contaminarlo al pasar las manos por encima.

11. Una vez desenroscado, lo volvemos a poner en la gradilla y fijamos la micropipeta en 400μl(0.4ml). Cogemos el tubo que contiene la sangre y conseguimos el volumen necesario.

12.Una vez conseguido el volumen necesario, realizamos lo mismo que anteriormente, depositamos este volumen en el tubo que contiene el medio de cultivo apoyando la punta de la micropipeta en la pared.

13. Una vez realizado todo esto, desechamos la punta de la micropipeta y cerramos los tapones de todos los tubos, con cuidado de no contaminarlos.

14. Una vez cerrado el tapón que contiene el medio de cultivo, la sangre y la fitohemaglutinina lo mezclaremos de la siguiente forma:

15.Una vez mezclado, sacamos el tubo de la cabina y lo etiquetamos poniendo el grupo que somos y la fecha, en este caso, grupo 4 18/01.

16. Una vez etiquetado lo llevamos a una estufa a 37 grados durante 72 horas.

Heparina(1):Sustancia anticoagulante natural que existe normalmente en todos los tejidos del cuerpo humano, especialmente en el hígado, los pulmones y los músculos.

 Fitohemaglutinina(2): Lectina que estimula la proliferación celular de los linfocitos T y su desdiferenciación a fibroblasto.

6.RESULTADOS Y ANÁLISIS DE RESULTADOS.

Hemos obtenido un tubo que contiene medio de cultivo, 0,4 ml de sangre y 0,25 ml de fitohemaglutinina.

7. CONSIDERACIONES DE SEGURIDAD.

• Es necesario usar el EPI correspondiente: guantes y bata.
• A la hora de usar la cabina de flujo laminar no utilizarla cuando los rayos UV están puestos.
• Los cultivos celulares son muy fáciles de contaminar por lo que hay que realizar una técnica aséptica muy estricta.

8. GESTIÓN DE RESIDUOS.

Las puntas de micropipetas fueron desechadas a un vaso de precipitado que ponía residuos y la sangre sobrante fue desechada a un contenedor de residuos biológicos.