PRÁCTICA 7: Viabilidad de las células utilizando colorante Azul tripán.

1.OBJETIVO.
Uso de la cámara de recuento de células, más conocida como cámara de Neubauer, para diferenciar las células muertas de las vivas a través del uso del colorante azul tripán.
2.FUNDAMENTO.
Para iniciar un cultivo se debe conocer la densidad celular (número de células/ml). Además, hay que confirmar que las células están vivas (viabilidad).
 Ambos procesos se realizan simultáneamente, mediante los siguientes métodos: 

• Coloración vital: generalmente se usa el azul tripán, un colorante que penetra en las células que tienen la membrana rota, pero no en las células vivas. Por tanto, al microscopio las células azules no son viables y las blancas son viables.

 • Recuento o contaje celular: se usa el colorante vital y se carga en una cámara de recuento o hemocitómetro, generalmente la cámara de Neubauer. Hay que tener en cuenta que se mezclan 10 μl de colorante con 10 μl de cultivo, y se recuentan 4 cuadrados de 1 mm de lado y 0,1 mm de altura.

3.MATERIALES.

Gradilla

Colorante azul tripán

Tres tubo eppendorf(1 para cada persona del grupo)

Micropipeta

Puntas de micropipeta

Cultivo celular

Etanol 70%

Cámara de Neubauer.

4.PROCEDIMIENTO.

Recuento de células.

1. Cogemos el t-flask con el cultivo de la incubadora.

2. Pipeteamos las células arriba y abajo 3 veces con una `pipeta de transferencia estéril para dispersar el cultivo.

3.Utilizando una pipeta ajustable, transferimos 10 µl de suspensión de células en un tubo eppendorf y volvemos a depositar el t-flask en la incubadora.

4.Añadimos 10 µl de azul tripán a las células del tubo eppendorf anterior y suavemente mezclamos pipeteando hacia arriba y hacia abajo.

5. Nosotros no conseguimos mezclarlo bien por lo que tuvimos que usar una microcentrifugadora.

6.Transferimos lentamente los 20µl resultantes en una cámara de Neubauer

7.Examinamos la cámara de Neubauer al microscopio cambiando de objetivo, el cual nos sirva para observar las lineas que presenta la cámara para realizar el recuento.

8.En nuestro caso, había muchas células y la dilución no era la correcta, tendríamos que haber puesto 5µl de cultivo y 15µl de azul tripán.

5.RESULTADOS Y ANÁLISIS DE RESULTADOS.

Como he dicho anteriormente, había muchas células y la dilución no era la correcta, tendríamos que haber puesto 5µl de cultivo y 15µl de azul tripán.

6.CONSIDERACIONES DE SEGURIDAD.

Es necesario usar el EPI correspondiente: guantes y bata.

A la hora de usar la cabina de flujo laminar no utilizarla cuando los rayos UV están puestos.

Los cultivos celulares son muy fáciles de contaminar por lo que hay que realizar una técnica aséptica muy estricta.

7.GESTIÓN DE RESIDUOS.

Los residuos generados fueron desechados a un vaso de precipitados etiquetado como ¨residuos¨ durante la práctica.