PRÁCTICA 6: Subcultivo de las células.
1.OBJETIVO.
El objetivo de esta práctica es alimentar adecuadamente con el medio de células de insecto, para que las células crezcan y se multipliquen en la superficie del frasco hasta alcanzar una confluencia del 100%.
2.FUNDAMENTO.
Los medios de cultivo son compuestos nutritivos que sustituyen el entorno natural en que se encuentran las células fisiológicamente.
Están formados por distintos componentes que son:
‒ Fuente de carbono: la glucosa es el sustrato energético más utilizado.
‒ Fuente de nitrógeno: con función estructural principalmente, aunque también energética. Se deben suplementar aminoácidos, al menos los aminoácidos esenciales. Pueden incluirse otros, según las necesidades de la línea celular.
‒ Vitaminas: influyen en la tasa de crecimiento y supervivencia celular, su composición depende del medio.
‒ Suero (al 2-50 %, normalmente 10 %): generalmente de ternera, suero bovino fetal o de caballo. Debe ser descomplementado para evitar lisis celulares.
‒ Sales minerales: básicamente es una solución salina fisiológica, con una composición equilibrada en NaCl, KCl, CaCl 2, MgCl 2 , fosfatos y bicarbonato de sodio (muy importante por ser un tampón fisiológico en equilibrio con el CO 2).
‒ Indicador de pH: se usan para detectar cambios en el pH que indiquen que se aleja del pH óptimo. El más usado es el rojo fenol, aunque hay muchas más opciones.
‒ Antibióticos y antifúngicos: esencial para evitar la contaminación por bacterias, hongos filamentosos y levaduras, en concentraciones que no sean tóxicas para las células
‒ Tampón: las células son muy sensibles a los cambios de pH, por lo que el medio tiene que estar tamponado. El más usado es el HEPES a 10-20 mM, debido a que tampona en rango fisiológico.
3.MATERIALES.
5.Usando una pipeta estéril 10 ml y un auxiliar de pipeteo, pipeteamos la suspensión celular hacia arriba y hacia abajo varias veces para separar las células restantes.
6.Utilizamos un microscopio para verificar el desprendimiento de las células de la parte inferior del frasco.
7.Cogemos el t-flask nuevo que vamos a utilizar para realizar el subcultivo y con la pipeta de 2 ml cogemos 1ml de medio y le añadimos 1 ml de medio.
8.Utilizando la misma pipeta, transferimos 1 ml de nuestro cultivo anterior.
El objetivo de esta práctica es alimentar adecuadamente con el medio de células de insecto, para que las células crezcan y se multipliquen en la superficie del frasco hasta alcanzar una confluencia del 100%.
2.FUNDAMENTO.
Los medios de cultivo son compuestos nutritivos que sustituyen el entorno natural en que se encuentran las células fisiológicamente.
Están formados por distintos componentes que son:
‒ Fuente de carbono: la glucosa es el sustrato energético más utilizado.
‒ Fuente de nitrógeno: con función estructural principalmente, aunque también energética. Se deben suplementar aminoácidos, al menos los aminoácidos esenciales. Pueden incluirse otros, según las necesidades de la línea celular.
‒ Vitaminas: influyen en la tasa de crecimiento y supervivencia celular, su composición depende del medio.
‒ Suero (al 2-50 %, normalmente 10 %): generalmente de ternera, suero bovino fetal o de caballo. Debe ser descomplementado para evitar lisis celulares.
‒ Sales minerales: básicamente es una solución salina fisiológica, con una composición equilibrada en NaCl, KCl, CaCl 2, MgCl 2 , fosfatos y bicarbonato de sodio (muy importante por ser un tampón fisiológico en equilibrio con el CO 2).
‒ Indicador de pH: se usan para detectar cambios en el pH que indiquen que se aleja del pH óptimo. El más usado es el rojo fenol, aunque hay muchas más opciones.
‒ Antibióticos y antifúngicos: esencial para evitar la contaminación por bacterias, hongos filamentosos y levaduras, en concentraciones que no sean tóxicas para las células
‒ Tampón: las células son muy sensibles a los cambios de pH, por lo que el medio tiene que estar tamponado. El más usado es el HEPES a 10-20 mM, debido a que tampona en rango fisiológico.
3.MATERIALES.
Baño termostático
Gradilla
Pipeta 2 ml
Pipeta esteril 10 ml
Alícuota con penicilina(medio de cultivo)
Auxiliar de pipeteo
Cultivo celular en t-flask.
4.PROCEDIMIENTO.
1.Colocamos la alicuota con penicilina en el baño termostático para que se adecue a la temperatura.
2.Enchufamos la cabina de flujo laminar durante 10 minutos para esterilizar la superficie. Una vez pasado ese tiempo desenchufamos los rayos UV de la cabina.
3. Desinfectamos todos los materiales con etanol 70% y procedemos a empezar con el subcultivo.
4. Golpeamos suavemente la parte inferior del frasco contra la palma de la mano para sacudir las células muertas.
6.Utilizamos un microscopio para verificar el desprendimiento de las células de la parte inferior del frasco.
7.Cogemos el t-flask nuevo que vamos a utilizar para realizar el subcultivo y con la pipeta de 2 ml cogemos 1ml de medio y le añadimos 1 ml de medio.
9.Suavemente movemos el t-flask suavemente para distribuir las células uniformemente.
10.Sacamos el t-flask y lo etiquetamos con la fecha y nombre del grupo.
11.Lo metemos en la incubadora y desinfectamos todos los objetos una vez fuera de la cabina. Activamos los rayos UV para esterilizar la superficie.
5.CONSIDERACIONES DE SEGURIDAD.
Es necesario usar el EPI correspondiente: guantes y bata.
A la hora de usar la cabina de flujo laminar no utilizarla cuando los rayos UV están puestos.
Los cultivos celulares son muy fáciles de contaminar por lo que hay que realizar una técnica aséptica muy estricta.
6.GESTIÓN DE RESIDUOS.
Todos los residuos generados fueron desechados a un vaso de precipitado etiquetado como "Residuos"
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